蛋白质的SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
【实验目的】
（1）掌握SDS-PAGE分离蛋白质的原理。
（2）掌握用SDS-PAGE检测蛋白质的方法及操作过程。
【实验原理】
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）。1967年，Shapiro等人首先发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入一定量的SDS，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的相对分子质量大小。
SDS是1种阴离子型去垢剂，带负电荷。因此，蛋白质在含有强还原剂的SDS溶液中与SDS分子结合时，可形成SDS-蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，使蛋白质本身带有的电荷被掩盖，起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用，因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小，从而达到分离目的蛋白的目的。同时，SDS-PAGE可以测定蛋白质的相对分子质量。当蛋白质的相对分子质量在15000～200000时，样品的迁移率与其相对分子质量的对数呈线性关系，符合以下方程式：
lg Mr＝－b×mR＋K
式中，Mr为蛋白质的相对分子质量；
mR为相对迁移率；
b为斜率；
K为截距。当条件一定时，b与K均为常数。
因此，通过已知相对分子质量的蛋白与未知蛋白的迁移率比较，就可以得出未知蛋白的相对分子质量。
【实验材料、试剂及仪器】
1．实验材料
实验31获得的经不同时间诱导的大肠杆菌。
2．实验试剂
（1）30％丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺29g，N，N′-亚甲基双丙烯酰胺1g，溶于60mL水中，加热至37℃溶解，定容到100mL，用0.45μm滤膜过滤，室温避光保存。
（3）分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris-HCl（pH8.8）。称取Tris36.3g，溶于200mL蒸馏水中，用浓盐酸调pH至8.8。
（4）浓缩胶缓冲液：1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8）。称取Tris12.1g，溶于200mL蒸馏水中，用浓盐酸调pH至6.8。
（5）10％过硫酸铵溶液：过硫酸铵1g加蒸馏水水定容到10mL，4℃下可贮存1周，但最好现配现用。
（6）四甲基乙二胺（TEMED）。
（7）10％（m/V）SDS溶液：称取10g SDS于100mL蒸馏水中，微热使其溶解。贮存液保存于室温，用前微热，使SDS完全溶解。
（8）5×Tris-glycine电泳缓冲液：称取Tris15.1g，甘氨酸94g，10％SDS50mL，加蒸馏水定容至1000mL。
（9）1mol/L DTT溶液：20mL0.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）中溶解3.09g二硫苏糖醇（dithiothreitol, DDT），过滤除菌后分装成1mL每份，－20℃贮存。
（10）2×SDS凝胶上样缓冲液：100mmol/L Tris-HCl（pH6.8），200mmol/L DTT（不含DTT的凝胶加样缓冲液800μL＋1mol/L DTT200μL。DTT现用现加。），4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油。
（11）染色液：称取考马斯亮蓝R2500.25g，溶于90mL蒸馏水中，加甲醇90mL，再加入冰乙酸10mL，搅拌使之充分溶解，必要时滤去颗粒状物质。
（12）脱色液：甲醇/冰乙酸/水（V∶V∶V＝3∶1∶6）。
（13）蛋白质分子大小标准参照物。
3．实验仪器
SDS-PAGE装置（每4人1套）
微量移液器（每2人1套）
高速离心机（每4人1台）
恒温摇床（全班1台）
－20℃冰箱（全班1台）
恒温水浴锅（每4人1台）
高压灭菌锅（全班1台）
电子天平（每8人1台）
1．5mL离心管（若干）
各种规格吸头（若干）
【实验步骤】
1．SDS—聚丙烯酰胺凝胶的灌制
（1）根据说明书安装玻璃板。
（2）按表14.1所示配制10％分离胶溶液。
表14.1 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳10％分离胶溶液配制表
（3迅速在两玻璃板的间隙中灌注10％分离胶溶液，留出灌浓缩胶 所需空间（梳子齿长＋1cm），覆一层重蒸水（覆盖水层可防止因氧气扩散进入凝胶而抑制聚合反应），将凝胶垂直放于室温下，大约20～40min后胶即聚合。
（4）倒出覆盖水层，用去离子水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的丙烯酰胺后，尽可能排去凝胶上的液体，最后用滤纸条吸净残留液体。
（5）按下表所示配制5％浓缩胶（本实验配制2～3mL即可）。
表14.2 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳5％浓缩胶溶液配制表
（5）由于加入TEMED后浓缩胶马上开始聚合，故应在已聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，然后立即在浓缩胶中插入干净的梳子，此时应小心避免混入气泡，再加入浓缩胶以充满梳子之间的空隙，待浓缩胶凝聚（约30min）后，拔除梳子。用去离子水洗涤梳子数次以除去未聚合的丙烯酰胺，并用滤纸条吸干残留液体。
2．样品的制备及电泳
（1）将1.5mL细菌培养液经10000r/min离心2min，收集菌体，存于－20℃冰箱中备用。将储存的菌沉淀样品＋5μL蒸馏水＋5μL2×SDS凝胶上样缓冲液在1个离心管中混合，100℃加热5min后，取出冷却至室温，12000r/min离心1min，取上清液。
（2）装好电泳系统，加入电泳缓冲液，上样8μL。
（3）将电泳装置与电源连接，在凝胶上加8V/cm电压，待染料前沿进入分离胶后将电压提高到15V/cm继续电泳，直至溴酚蓝达到分离胶的底部。电泳过程约需80～150min。
（4）卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色过夜。加入脱色液，置于80r/min脱色摇床上，每20min更换1次脱色液至完全脱净。
（5）将脱色后的凝胶照相或干燥，也可用塑料袋密封在20％甘油水溶液中长期保存。
【典型实验结果分析】
理想实验结果（见图14.2，泳道3，4）含有外源基因的重组质粒的菌株经IPTG诱导后表达出目的蛋白片段。而不含重组质粒的菌株则不表达该蛋白片段。
图14.2 大肠杆菌外源基因表达蛋白的SDS-PAGE结果
1：蛋白质分子大小标准参照物；2～3：表达蛋白样品；4：空白对照
【实验注意事项】
（1）实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。
（2）为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10％AP在一周内使用。室温较低时，TEMED的量可加倍。
（3）未聚合的丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。
（4）在“实验步骤”1中（2）、（4）配制溶液时，一旦加入TEMED，胶马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作
（5）【参考文献】
［1］杨安钢等．生物化学与分子生物学实验技术．北京：高等教育出版社，2008.
［2］梁宋平．生物化学与分子生物学实验教程．北京：高等教育出版社，2002.
［3］郭勇．现代生化技术．广州：华南理工大学出版社，2001.
［4］Boyer RF. Modern Experimental Biochemistry. Addison-Wesley Publishing Company Inc, 2000.
［5］Hanahan D, Jessee J, and Bloom FR. Plasmid transformation of E. coli and other bacteria. Methods in Enzymology, 1991, 204: 63～113.
一起来看！SDS-PAGE电泳实验原理、作用机理及操作流程
1、原理：
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE）是聚丙烯酰胺凝胶电泳中最常用的一种蛋白表达分析技术。此项技术的原理，是根据检体中蛋白质分子量大小的不同，使其在电泳胶中分离。聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应，蛋白质在电场中支持物上的迁移率差异主要依赖于样品中各种分子携带的电荷，分子大小与形状的差别。聚丙烯酰胺凝胶电泳系统加入阴离子去垢剂SDS，蛋白质在加热变性以后与SDS结合，带上负电荷，在电场的作用下，向正极移动，结果按分子量大小排列在胶板上，含量多的蛋白带纹粗，蛋白质的迁移率主要取决于分子量大小。SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。在大肠杆菌表达纯化外源蛋白的实验中，SDS-PAGE 更是必不可少的操作，其通常用于检测蛋白的表达情况（表达量，表达分布），以及分析目的蛋白的纯度等。
2、作用机理
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选Tris/HCl缓冲液，电极液选Tris/甘氨酸。电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成一稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。
3、SDS-PAGE实验标准操作流程
（1）清洗玻璃板
一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
SDS-PAGE电泳仪器
（2）灌胶与上样
玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶）。根据蛋白分子量的不同配制不同浓度的分离胶，加入 TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，用枪吸取适量的胶沿玻璃放出，待胶面升到玻璃板合适的高度即可。然后胶上加一层水（无水乙醇也可），液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型）。待分离胶凝固后加入浓缩胶。
胶凝好后拔出梳子，加入足够的电泳液后开始准备上样（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板）。加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出，可能造成其他孔中样品污染。
SDS-PAGE电泳上样
3、电泳
加样完毕，盖好上盖，连接电泳仪，打开电泳仪开关后，设置好电压。待样品跑至浓缩胶后再调高电压直至溴酚蓝指示剂迁移到距前沿1～2cm 处即停止电泳。
4、染色、脱色
电泳结束后，关掉电源，取出玻璃板，将胶面与一块玻璃板分开后放入大培养皿中染色，使用 0.25％的考马斯亮蓝染液，染色 2～4h，必要时可过夜。弃去染色液，用蒸馏水把胶面漂洗几次，然后加入脱色液，进行扩散脱色，经常换脱色液，直至蛋白质带清晰为止。
文章来源：每日生物评论
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干货分享｜SDS-PAGE蛋白电泳实验总结
电泳是分离蛋白质和其他物质如核酸、嘌呤、嘧啶、一些有机化合物甚至无机离子的主要技术，目前的大部分电泳是将样品分离到固定介质中的流动相中。聚丙烯酰胺凝胶是主要介质之一，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）在蛋白质分子量测定、特异性蛋白质检测、菌种鉴定等方面具有操作简单、重现性好等特点，因此被广泛使用。
实验原理:
SDS-PAGE电泳是由SDS（十二烷基硫酸钠）和还原试剂将蛋白分子解聚后因亚基的大小不同，在恒定PH（碱基）缓冲系统中对其进行分离。
SDS是一种阴离子去污剂，它能将分子内和分子间的氢键断裂，使蛋白质分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。此外，强还原剂，如β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。
因此，在样品和凝胶中加入SDS和强还原剂后，100℃保温3～5分钟（目的是将SDS与蛋白质充分结合），与强还原剂一起使蛋白质分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化，蛋白质分子被解聚为多肽链，解聚后，氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。
蛋白质-SDS胶束具有以下特点：
①大多数蛋白质与SDS结合重量比为1:1.4（即1g蛋白质结合1.4gSDS）；
②椭圆棒的短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的；
③长轴长度与蛋白质亚基的分子量大小成正比；
④所带的负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异。
因此蛋白质-SDS胶束在凝胶系统中，电泳迁移率不再受电荷影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度（即蛋白质的分子质量大小）。电泳迁移率与分子质量的对数呈线性关系。
所以，通过SDS-PAGE蛋白电泳，可以实现蛋白质按照分子量大小进行分离的最终效果。
主要实验步骤：
1. 分离胶的制备
制备分离胶需要两块玻璃板，一个短板，一个长板，将两块板夹在制胶架上，灌胶完成后，加异丙醇（或者纯化水）赶走凝胶上面的气泡。关于灌胶的高度，这可以通过放置梳子来确定，一般大约梳子下1cm，用笔标记制胶的高度，开始灌胶，加异丙醇（或纯化水）封胶。等待40min以上胶凝固后，倒掉上层异丙醇，用吸水纸吸干异丙醇。
2. 浓缩胶的制备
当下层凝胶凝固后，就可以开始直接加积层胶至玻璃最上层，然后插入梳子 。等待积层胶凝固后，小心拔出梳子避免用力过猛破坏凝胶上样孔。
3. 点样至凝胶孔中
用微量移液器向凝胶孔中依次加入蛋白marker和样本，蛋白marker是已知蛋白条带分子量的预染蛋白，可作为标定蛋白大小的标尺参考。每孔的样本上样量保持一致（主要是质量一致），加样需小心，不能破坏加样孔的尺寸或使样品溢出孔外，更不能把样品加到孔外。
4. 电泳
将凝胶和玻璃板浸入电泳缓冲液后，就可以设定电压开始电泳了，当示踪染料到达或穿过凝胶时，停止电泳。
5. 分析蛋白条带
可选用考马斯亮蓝染色或者蛋白转膜以进行后续的免疫印迹实验。考马斯亮蓝染色，室温摇床孵育（转速不能太大），一般蛋白条带会在几分钟后开始出现，但是完全染色大约需要一个小时。
实验影响因素
蛋白质与SDS的结合程度是SDS-PAGE电泳成功的关键之一，其影响主要有以下三个：
●溶液中SDS的单体浓度：SDS在水溶液中是以单体和SDS多肽束的混合形式存在的，而单体才能与蛋白质结合。单体浓度与SDS总浓度、温度和离子强度有关，在一定温度和离子强度下，当SDS总浓度增加到一定值时，单体浓度不再随SDS总浓度增加而增加，此时的单体浓度称为SDS单体的平衡浓度。
若单体的平衡浓度低于0.5mol/L，蛋白质与SDS的结合重量比仅为1:0.4，这样就很难消除蛋白质分子之间原有的电荷差异，就不能进行分子质量测定。要使蛋白质与SDS充分结合，其结合重量比应为1:4或1:3。
●样品缓冲液的离子强度：由于蛋白质与SDS的结合量只与SDS单体的平衡浓度有关，并非SDS总浓度。
而只在低离子强度的溶液中，SDS单体的平衡浓度才会比较高。
因此，SDS-PAGE电泳的样品缓冲液的离子强度应较低为宜，通常为10～100mmol/L。
●二硫键是否完全被还原：只有当二硫键被彻底还原之后，蛋白质才能被解聚，SDS才能充分与蛋白质分子结合，从而给出电泳迁移率和分子质量的对数线性关系。
β-巯基乙醇常用浓度为5～20mM，DTT为0.5～1mM。β-巯基乙醇还原能力较差，效果一般只能维持2～3天；DTT有两个巯基基团，其作用能维持3～7天。
但碱性条件下，β-巯基乙醇还原效果要好于DTT。另外DTT可以使Ni被还原，因此在用Ni柱纯化His标签的蛋白时要避免使用DTT，而应该考虑β-巯基乙醇。
DTT的刺激性气味要小很多，毒性也比巯基乙醇低很多，但由于容易被空气氧化，因此DTT的稳定性较差。β-巯基乙醇具有挥发性，最好在配制样品前加入。